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STED - Mikroskopie jenseits optischer Grenzen

Stefan Hell (Chemie-Nobelpreis 2014): STED - Lichtblicke in die Nanowelt

Schärfer als das Licht erlaubt

STED-Mikroskop: Der Laserstrahl rastert eine Probe mit Farbstoffmolekülen (Punkte unten) ab. Der ausgeleuchtete Fleck ist wegen der Abbe-Grenze immer mindestens 200 Nanometer breit. Links: Der Ausschaltestrahl hat ein Profil der Lichtintensität wie ein Donut. Er unterdrückt die Fluoreszenz der Moleküle (blau).Mitte: Das breite Profil des Einschaltestrahls erinnert an eine zerlaufende Eiskugel, er lässt alle Farbstoffmoleküle im ausgeleuchteten Fleck fluoreszieren (rot).Rechts: Beide Strahlen sind überlagert und lassen die Moleküle auf einem Fleck leuchten, der nun viel kleiner als 200 Nanometer ist. Bild vergrößern
STED-Mikroskop: Der Laserstrahl rastert eine Probe mit Farbstoffmolekülen (Punkte unten) ab. Der ausgeleuchtete Fleck ist wegen der Abbe-Grenze immer mindestens 200 Nanometer breit.
Links: Der Ausschaltestrahl hat ein Profil der Lichtintensität wie ein Donut. Er unterdrückt die Fluoreszenz der Moleküle (blau).
Mitte: Das breite Profil des Einschaltestrahls erinnert an eine zerlaufende Eiskugel, er lässt alle Farbstoffmoleküle im ausgeleuchteten Fleck fluoreszieren (rot).
Rechts: Beide Strahlen sind überlagert und lassen die Moleküle auf einem Fleck leuchten, der nun viel kleiner als 200 Nanometer ist. [weniger]

Stefan Hell war klar, dass er die Gesetze der Wellenoptik nicht aushebeln kann. Er akzeptierte sie. Stattdessen konzentrierte er sich auf die Beobachtungsobjekte. Und hier konnte er eine Besonderheit der Biowissenschaften ausnutzen. Ernst Abbes Beugungsgitter werden - wie auch viele Objekte unter dem Mikroskop - passiv von einer Lichtquelle beleuchtet. In der biomedizinischen Forschung werden interessante Moleküle aber mit einem fluoreszierenden Farbstoff als Marker versehen - sie leuchten also aktiv selbst. Fluoreszenz heißt, dass eine Lichtquelle die Farbstoffmoleküle dazu anregt, selbst wie winzige Nano-Lampen in einer charakteristischen Farbe, also Wellenlänge, zu leuchten. Und das funktioniert auch in lebenden Zellen.

„Proteine zum Beispiel kann man nur optisch unterscheiden, wenn sie an einen Farbstoff gebunden sind", begründet Hell die Bedeutung dieser Methode. Er kam auf die Idee, mit Hilfe diese molekularen Lampen die Abbesche Beugungsgrenze zu durchbrechen. Seine Basis war eine etablierte Mikroskoptechnik, bei der ein sehr scharf gebündelter Laserstrahl die Probe abrastert. Sie erzeugt so Punkt für Punkt ein Bild. Diese Technik erreicht eine besonders hohe Auflösung. Sie unterliegt aber noch dem Abbe-Limit: Die Optik lässt den Laserstrahl durch Beugung an ihrer Öffnung auf mindestens den 200-Nanometer-Fleck aufblühen. In diesem Fleck fluoreszieren alle dort befindlichen Farbstoffmoleküle. Ihre Nano-Leuchtpunkte verschwimmen im Mikroskopbild zu einem gemeinsamen Punkt.

Damit wäre also noch nichts gewonnen. Nun aber kommt Hell`s Idee ins Spiel, und die klingt verblüffend einfach: „Man muss die fluoreszierenden Moleküle einfach in einem größeren Bereich des Beleuchtungsflecks dunkel schalten", sagt der Physiker, „dann bekommt man eine höhere Auflösung." Dieses „Ausknipsen" der meisten leuchtenden Moleküle im äußeren Ring des Flecks ist der entscheidende Trick: Nur in einem sehr schmalen Bereich in der Mitte des Strahls leuchten dann noch Moleküle. Dieser „Restbereich" lässt sich so klein machen, dass „es nach unten eigentlich keine Grenze gibt", sagt Hell. „Und bei den Molekülen, die im Lichtfleck noch angeregt sind", fährt er fort, „weiß ich genau, wo die sind."

Die Information über den präzisen Ort der noch leuchtenden Moleküle liefert nicht das dem Abbe-Limit unterworfene Bild, sondern die Position des Laserstrahls. Das ermöglicht die moderne Scannertechnik, wie sie auch in den berühmten Rastertunnel-Mikroskopen eingesetzt wird. Die Position des Laserstrahls steuern Piezokristalle, die elektrische Signale ultrapräzise in winzigste mechanische Bewegungen umwandeln, auf Nanometer genau. So lassen sich die Rasterpunkte am Computer tatsächlich zu einem lichtmikroskopischen Bild zusammensetzen, das nur wenige Nanometer kleine Strukturen scharf abbildet. Es ist damit viel schärfer, als es das Abbe`sche Beugungslimit erlauben würde. Sogar Videosequenzen sind möglich.

 
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