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STED - Mikroskopie jenseits optischer Grenzen

Stefan Hell (Chemie-Nobelpreis 2014): STED - Lichtblicke in die Nanowelt

Schärfer als das Licht erlaubt

Schärfer als das Licht erlaubt

Forscher überwinden die Grenzen der Lichtmikroskopie
Filamente von Vimentin in einer Zelle. Das Protein ist ein Element des Zellskeletts von Wirbeltieren. Das Bild im Hintergrund wurde konventionell aufgenommen, das im Sichtfeld des Mikroskops mit einem STED-Mikroskop, das die Beugungsgrenze der klassischen Lichtmikroskopie durchbricht. Bild vergrößern
Filamente von Vimentin in einer Zelle. Das Protein ist ein Element des Zellskeletts von Wirbeltieren. Das Bild im Hintergrund wurde konventionell aufgenommen, das im Sichtfeld des Mikroskops mit einem STED-Mikroskop, das die Beugungsgrenze der klassischen Lichtmikroskopie durchbricht. [weniger]

Im 16. Jahrhundert notierte der italienische Arzt Girolamo Fracastoro, dass zwei hintereinander angeordnete optische Linsen ein Objekt näher und vergrößert erscheinen lassen sollten. Damit beschrieb er wahrscheinlich zum ersten Mal ein Mikroskop. Optische Linsen kannte man damals schon als Brille. Fracastoros Idee, sie gezielt zur Vergrößerung kleiner Gegenstände einzusetzen, war jedoch neu. Es sollte aber noch bis zum Anfang des 17. Jahrhunderts dauern, bis die ersten Lichtmikroskope gebaut wurden. Wann das genau geschah, ist unklar. Historisch gesichert ist jedenfalls, dass der niederländische Brillenmacher Hans Janssen und sein Sohn Zacharias im Jahr 1608 auf der Frankfurter Messe ein Mikroskop vorführten. Ein Jahr später präsentierte Galileo Galilei in Rom sein erstes Gerät.

Allerdings waren diese ersten Lichtmikroskope kaum brauchbar, denn sie litten unter fehlerhaften Linsen. Der Durchbruch gelang erst dem Niederländer Antonie van Leeuwenhoek mit einem radikal vereinfachten Design: Sein Mikroskop bestand nur aus einer einzigen Linse, es war also eigentlich eine Hochleistungslupe. Dafür hatte van Leeuwenhoek diese Linse mit einer zuvor unerreichten Präzision geschliffen. Bei fast 300-facher Vergrößerung entdeckte der Niederländer die damals völlig unbekannte Welt der Mikroben. Die Menschheit verdankt dem Lichtmikroskop einen gigantischen Zuwachs an Wissen über unsere Welt. Ohne Mikroskopie wäre zum Beispiel die moderne Medizin nicht denkbar.

Im 19. Jahrhundert wurden die Lichtmikroskope immer leistungsfähiger. Doch stieß ihre Technik an eine Grenze: Die Vergrößerung ließ sich nicht beliebig steigern. Der Jenaer Physikprofessor Ernst Abbe und der englische Physiker Baron Rayleigh erkannten fast zur gleichen Zeit: Sobald feine Objektdetails ungefähr so eng beieinander sitzen wie es der Wellenlänge des Lichts entspricht, kann ein Mikroskop sie nicht mehr voneinander getrennt abbilden. Schuld daran sind die Welleneigenschaften des Lichts. Eine Optik kann es nicht unendlich scharf bündeln: Die Brennpunkte der Strahlen blühen unweigerlich zu „Brennflecken" auf. Diese Flecken sind mindestens eine halbe Wellenlänge des eingesetzten Lichts groß. Alle feineren Strukturen innerhalb dieser Flecken sind im Mikroskopbild nicht mehr erkennbar.

Ernst Abbe begründete 1873 wissenschaftlich präzise, dass die Auflösung eines optischen Mikroskops nie über die „halbe Wellenlänge des blauen Lichts um ein Nennenswertes hinausgehen wird". Blaues Licht hat die kürzeste Wellenlänge im sichtbaren Spektrum, die Hälfte davon entspricht rund 200 Nanometern (Milliardstel Meter). Wegen dieses „Abbe-Limits" können Lichtmikroskope Objekte, die kleiner sind, nicht mehr abbilden. Dazu gehören zum Beispiel die meisten Viren. Es gilt auch für alle Moleküle des Lebens, selbst wenn viele davon außerordentlich groß sind. Besonders für die Biowissenschaften musste es demnach ein schöner Traum bleiben, durch das Mikroskop den Tanz der Moleküle in lebenden Zellen - also live - enträtseln zu können.

Stefan Hell hat in den Nenner der Abbe'schen Formel den Wurzelterm eingeführt. Demnach verkleinert sich ∆x, der Abstand zwischen zwei gerade noch zu unterscheidenden Punkten, wenn die Intensität I des Lasers steigt, der die Emission der angeregten Fluoreszenzmoleküle induziert. So kann man berechnen, wie weit sich durch die technischen Tricks die Auflösungsgrenze senken lässt. Bild vergrößern
Stefan Hell hat in den Nenner der Abbe'schen Formel den Wurzelterm eingeführt. Demnach verkleinert sich ∆x, der Abstand zwischen zwei gerade noch zu unterscheidenden Punkten, wenn die Intensität I des Lasers steigt, der die Emission der angeregten Fluoreszenzmoleküle induziert. So kann man berechnen, wie weit sich durch die technischen Tricks die Auflösungsgrenze senken lässt. [weniger]

Abbes Theorie bietet praktisch nur eine Möglichkeit, die Auflösung eines Mikroskops zu steigern: Man verkürzt die Wellenlänge des Lichts. Leider wird aber das Glas der Linsen schon für ultraviolettes Licht undurchsichtig. Daran scheiterte eine weitere Steigerung der optischen Auflösung von Lichtmikroskopen. Erst im 20. Jahrhundert zeigte die aufkommende Quantenphysik einen Ausweg auf: Teilchen sind zugleich Wellen, und Elektronen sind wesentlich kurzwelliger als Licht. Zudem lassen sich die Strahlen solcher elektrisch geladener Teilchen mit „Linsen" aus elektrischen und magnetischen Feldern fokussieren. So konnten Elektronenmikroskope die Nanowelt erschließen und sogar einzelne Atome abbilden. Allerdings benötigen sie meistens Vakuum und mit Metall bedampfte Proben. Das überlebt keine Zelle. Inzwischen gibt es zwar auch schonendere Verfahren, aber auch diese eignen sich nicht für lebende Objekte. So mussten die Forscher akzeptieren, dass sie molekulare Details nur an toten Präparaten untersuchen können. Damit können sie aber die komplizierten Lebensprozesse nur mühsam auf indirekte Weise entschlüsseln.

Lange galt das Abbe-Limit als ultimative Grenze der Lichtmikroskopie - genauer gesagt, der Fernfeld-Mikroskopie. Fernfeld heißt, dass das Objektiv des Mikroskops viele Lichtwellenlängen vom Objekt entfernt ist. Tatsächlich konnte die sogenannte Nahfeld-Mikroskopie in den 1980er-Jahren erstmals das Abbe-Limit bei sichtbarem Licht durchbrechen. Sie rückt mit einer Präzisionssteuerung eine spitzenförmige Optik auf wenige Nanometer an das Objekt heran - also viel weniger als die Lichtwellenlänge. Allerdings sind ihre Abbildungseigenschaften kompliziert und kaum auf Zellen und Gewebe anwendbar. Deshalb blieb die optische Nahfeld-Mikroskopie eine Spezialanwendung.

Die Abbe-Grenze der Fernfeld-Mikroskopie durchbrach erst Ende der 1990er-Jahre ein junger deutscher Physiker erfolgreich. Wer mit Stefan Hell, Direktor am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen, darüber spricht, hört eine Lebensgeschichte, die eines lehrt: Auch in den Naturwissenschaften muss man grundlegend neue Ideen oft mit Mut, Optimismus und großer Zähigkeit durchsetzen. Hell hat diese Steherqualität. Als er vor rund zwanzig Jahren als junger Physiker zunächst in Heidelberg versuchte, etablierte Wissenschaftler von seinen Ideen zu überzeugen, scheiterte er. „Das war einfach zu radikal", sagt Hell im Rückblick. Schließlich bekam er 1997 am Göttinger Max-Planck-Institut die Chance, als Nachwuchswissenschaftler seine Idee zu verwirklichen. Nach drei Jahren war klar, dass es tatsächlich funktioniert. Heute ist Hell ein international berühmter Wissenschaftler, der u.a. 2006 den Innovationspreis des Bundespräsidenten erhalten hat. Wie aber funktioniert seine radikal neue Idee?

Um das zu verstehen, müssen wir nochmals zurück in das 19. Jahrhundert und Ernst Abbe über die Schulter schauen. Abbe experimentierte damals mit Beugungsgittern. Diese Glasplättchen mit ihren sehr feinen, parallel eingeritzten Linien gehören heute zum Schulunterricht in Physik. Damals waren sie wissenschaftliches Neuland. Der Abstand der Linien liegt im Wellenlängenbereich von sichtbarem Licht, also bei einigen Hundert Nanometern. Fällt Licht durch so ein Gitter, dann bricht es dessen parallele Wellenfront in kleine Kreiswellen auf. Diese wandern in den Raum jenseits des Gitters. Steht dort ein Leuchtschirm, dann überlagern sie sich auf ihm zu einem hellen Fleck in der Mitte und einer Reihe kleinere Lichtflecken links und rechts.

Von links fällt eine ebene Lichtwelle auf ein Beugungsgitter als Objekt, das hier drei Öffnungen hat. In den Öffnungen bricht die Lichtwelle in einzelne Kreiswellen auf. Diese überlagern sich auf dem Weg zur Öffnungslinse des Mikroskops. In den Maxima tun sie das konstruktiv, dazwischen löschen sie sich aus. Die gelben Pfeile deuten die Positionen des Hauptmaximums und der beiden ersten Nebenmaxima an. Letztere fängt das Objektiv im linken Fall gerade noch ein, das Mikroskop bildet das Gitter erkennbar ab. Bei engerem Gitter und unveränderter Wellenlänge des Lichts (rechts) spreizen die Nebenmaxima sich zu weit für das Objektiv auseinander. Das Mikroskopbild enthält keine Information mehr. Bild vergrößern
Von links fällt eine ebene Lichtwelle auf ein Beugungsgitter als Objekt, das hier drei Öffnungen hat. In den Öffnungen bricht die Lichtwelle in einzelne Kreiswellen auf. Diese überlagern sich auf dem Weg zur Öffnungslinse des Mikroskops. In den Maxima tun sie das konstruktiv, dazwischen löschen sie sich aus. Die gelben Pfeile deuten die Positionen des Hauptmaximums und der beiden ersten Nebenmaxima an. Letztere fängt das Objektiv im linken Fall gerade noch ein, das Mikroskop bildet das Gitter erkennbar ab. Bei engerem Gitter und unveränderter Wellenlänge des Lichts (rechts) spreizen die Nebenmaxima sich zu weit für das Objektiv auseinander. Das Mikroskopbild enthält keine Information mehr. [weniger]

Dieses sogenannte Beugungsbild enthält die Bildinformation über das Gitter. Abbe erkannte, dass man mindestens die beiden ersten Flecke, die „Nebenmaxima" neben dem Hauptfleck, als Information braucht, damit das Bild das Aussehen des Beobachtungsobjekts erkennbar wiedergibt. In diesem Fall wäre das Objekt also das Beugungsgitter. Je näher dessen Gitterlinien zusammenrücken, je feiner es wird, desto weiter spreizen sich aber die Nebenmaxima auseinander. Abbe erkannte, dass dieser Zusammenhang nicht nur für optische Gitter gilt, sondern für alle Beobachtungsobjekte. Daraus folgerte er: Die Objektivöffnung eines Mikroskops, die sogenannte Apertur, muss grundsätzlich die ersten Nebenmaxima des am Beobachtungsobjekt gebeugten Lichts erfassen können. Nur dann enthält das Mikroskopbild eine Mindestinformation über das Objekt. Ansonsten sieht man im Okular nur gleichförmige Helligkeit.

 
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